La calcéine-AM non fluorescente, qui est perméante, reste piégée dans les cellules vivantes grâce au clivage du groupement AM par les estérases cellulaires ; la calcéine hydrophile ainsi formée émet une fluorescence verte.
Puis OVERTON a trouvé qu’un grand nombre de substances perméantes ont un facteur de répartition entre l’huile et l’eau très élevé en faveur de l’huile, tandis que ce facteur est très bas pour les substances non-perméantes.
On peut en conclure que les perméants hydrophiles utilisés ne donnent pas lieu à une adsorption sensible sur les structures musculaires (auquel cas R aurait une tendance à augmenter dans le domaine des concentrations faibles).